Молекулярні основи варіації фертильності у кріоконсервованій спермі бугаїв: функціональна оцінка та аналіз експресії генів IZUMO1, PLCζ та CatSper

Анотація

Кріоконсервація сперми є ключовим біотехнологічним інструментом, який застосовують у програмах штучного осіменіння для покращення генетичних ознак великої рогатої худоби. Проте цикл заморожування-розморожування може суттєво знижувати ефективність запліднення через сублетальні клітинні, функціональні та молекулярні пошкодження. Метою цього дослідження було оцінити вплив кріоконсервації на традиційні параметри спермограми та відносний вміст транскриптів, пов’язаних із фертильністю генів-мішеней (CatSper, IZUMO1 та PLCζ) у паєтах із замороженою спермою бугаїв-плідників із високою та низькою фертильністю. У межах ретроспективного дослідження було проаналізовано 92 зразки розмороженої сперми (50 від високофертильних і 42 від низькофертильних тварин). Кінетичні характеристики рухливості сперматозоїдів визначали за допомогою комп’ютерного аналізу CASA, тоді як структурну життєздатність, цілісність плазматичної мембрани та нормальну цитоморфологію оцінювали відповідно методом виключення еозину-нігрозину, гіпоосмотичним тестом (HOST) та фарбуванням Diff-Quik. Для визначення відносної експресії генів, нормованої за референсним геном GAPDH, виконували кількісну ПЛР у реальному часі (RT-qPCR) за порівняльним математичним методом 2−ΔΔCt. Аналіз спермограми продемонстрував статистично значуще зниження спрямованої прогресивної рухливості (62,7 проти 65,4 %; P=0,011), структурної життєздатності (78,5 проти 80,2 %; P=0,045) та функціональної цілісності мембран (72,2 проти 74,6 %; P=0,045) у групі з низькою фертильністю, що супроводжувалося пригніченням показника нормальної морфології сперматозоїдів (73,7 проти 78,1 %; P=0,0001). Навпаки, загальна рухливість сперматозоїдів не виявила значущої статистичної різниці між вибірками (74,0 проти 77,9 %; P=0,063). На молекулярному рівні всі три досліджувані транскрипти продемонстрували глибоке пригнічення в субфертильній групі: зниження експресії IZUMO1 у 2,43 раза, PLCζ у 2,78 раза та CatSper у 3,45 раза, що підтвердило чітку ієрархію нестабільності кількості транскриптів (P<0.001). Дослідження доводить, що кріоконсервація зумовлює виражену деградацію мРНК, яка безпосередньо порушує процеси гіперактивації джгутика, злиття гамет та активації ооцита в процесі запліднення. Отримані результати свідчать, що інтеграція кількісного аналізу експресії генів з метою оцінки якості сперми забезпечує високу точність діагностики прихованої субфертильності плідників, оптимізує добір паєт зі спермою і підвищує ефективність програм штучного осіменіння.